結合重組酶介導的核酸等溫擴增和熒光探針快速檢測日本血吸蟲基因片段-江蘇血防所

【摘要】目的結合重組酶介導的核酸等溫擴增(recombinase aided amplificaion，RAA)和熒光探針方法建立日本血吸蟲特異性基因片段的快速檢測方法。方法以日本血吸蟲G28(SjG28)基因片段作為靶序列，應用 DNAMAN 70軟件設計合成引物及熒光探針，建立熒光RA 反應體系。擴增不同拷貝數的sic28重組質粒評價熒光 RAA 檢測的敏感性;分別以日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、細粒棘球絳蟲、十二指腸鉤口線蟲、似蚓蛔線蟲、華支睪吸蟲基因組為模板進行熒光 RAA檢測，以評價該方法的特異性。采用熒光 RAA 分別檢測 500、200 和50條日本血吸蟲尾蚴感染的免糞中蟲卵 DNA:分別在 50 只陰性釘螺中混人1、2、3、4、5、10 只陽性釘螺，并提取 DNA 進行熒光 RAA 檢測。結果以不同拷貝數的 S;G28重組質粒為模板進行熒光RAA擴增，在5min 時即可觀察到明顯的熒光信號，隨著拷貝數的不斷降低，檢測到熒光信號的時間也隨之延長。不同拷貝數的擴增均在10 mn內完成，最低可檢出的質粒濃度為 10拷貝/。以曼氏血吸蟲、細粒棘球絳蟲、十二指腸鉤口線蟲、似蚓蛔線蟲及華支睪吸蟲基因組 DNà 為模板的熒光 RAA 擴增結果均為陰性。不同劑量尾蚴感染的免糞中提取的 DNA 樣品經熒光 RAA 檢測，均能得到有效的擴增，檢測可在 15 mn 內完成。含不同數量陽性釘螺的 50 只陰性釘螺提取的日本血吸蟲 DNA經熒光 RAA 檢測,均能得到有效的擴增，檢測可在 10min 內完成。結論本研究建立的可檢測日本血吸蟲核酸片段的熒光 RAA方法，反應快捷，感性和特性均較高。

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